近日，真迈生物与合作单位上海交通大学医学院附属第一人民医院在Frontiers in Genetics的Genomic Assay Technology版块上发表了题为“Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers”的研究成果。该研究涵盖了两种肿瘤panel：TSO500和TargetSeq One；三种典型样本：FFPE，cf DNA（cell-free DNA） 和cell line；六个主流的NGS测序平台：NovaSeq 6000，NextSeq 550，MGISEQ 2000，GenoLab M，FASTASeq 300，SURFSeq 5000；五种常用的突变分析软件：HaplotypeCaller，Mutect2，SiNVICT，SNVer和VarScan 2。
靶向基因组测序(TS)是一种有效的高通量测序(NGS)方法，重点关注与疾病发病机制或临床相关的一组基因或靶点。它通过快速检测基因变异，为临床医生提供参考，帮助他们解释病人基因图谱，并为实施个性化的抗癌提供建议，极大地促进了肿瘤精准化的发展。
TSO500是一个全面的靶标测序panel，涵盖超过8种癌症类型和523种癌症相关基因(1.94 Mb)，用于捕获FFPE标准品HD832，而TargetSeq One kit 用于富集Twist cf DNA。本研究中，6个乳腺癌和卵巢癌的cell line的panel数据来自于公开数据库SRA。
TSO500靶向测序平台与软件间的比较
如图1a和1b所示，NovaSeq 6000，NextSeq 550，GenoLab M和FASTASeq 300四个测序平台在SNP和InDel检测的灵敏度（sensitivity）方面表现出几乎一致的结果，虽然SiNVICT和Mutect2在InDel的calling上有一些细微差异。FASTASeq 300测序仪基于SNVer和VarScan2软件，可以检出样本中全部的SNP和InDel突变（sensitivity=100%）。对于F-score和精确度（precision），SNVer和VarScan2在SNP和InDel检测上也表现最好。此外，与ddPCR验证的真集相比，四个测序平台一致性都比较高，特别是使用SNVer和VarScan2两个分析工具(1c）。
Pearson相关系数(r)热图(图1d)显示，在相同的软件下，不同测序平台呈现出相似的整体性能。随后，研究者比较了不同测序平台与分析软件间高置信度变异的检测数量(图1e)，发现所有数据集的一致性高达93.4%(198/212)。其中，FASTASeq 300能检测到更多的特有突变，特别是通过SNVer和VarScan2两个软件。
综上，在SNP和InDel的突变检出方面，分析软件间比测序平台间表现出的差异更大，FASTASeq 300在SNVer和VarScan2软件下表现更优。
一般而言，测序深度的增加有助于变异检测结果的重现和低频突变的检出，但需要更长的分析时间、更高的计算复杂度以及成本。研究者以突变检出表现最好的FASTASeq 300测序平台和SNVer以及VarScan2两款软件为研究重点，比较了不同测序深度下变异检测时间、内存使用、SNP和InDel检测灵敏度的差异，期望探索到保证高灵敏度的情况下所需的最低测序深度(图1f和1g，结果表明：至少500x的测序深度可以保证全部突变的检出，而VarScan2软件消耗内存更少，运行时间更短）。
TargetSeq One捕获的cf DNA测序平台与分析软件的比较
对于cf DNA样本，软件SNVer和VarScan2在SNP和InDel检测方面表现出色。F-score, 召回率（recall）和精确度都接近100% (Fig. S2)，三个测序平台NovaSeq 6000，MGISEQ 2000和SURFSeq 5000结果也很一致。
cell line样本的分析软件比较
通过下载公开数据集，研究者获取到3个乳腺癌和3个卵巢癌的panel测序结果，并使用上述五款软件进行突变检测，结果表明：SNVer和VarScan2两款软件同样表现更优，其检测结果最接近真集。
不同测序平台在同一个分析软件下，突变检测的一致性较好。三种类型的肿瘤样本，在突变检测方面，SNVer和VarScan2均表现最优。该项研究为肿瘤靶向测序提供了一个benchmark。该研究使用五种软件对三种典型的肿瘤样本进行变异检测的性能评估，也为未来肿瘤变异研究提供了有价值的参考。
Feng B, Lai J, Fan X, et al. Systematic comparison of variant calling pipelines of target genome sequencing cross multiple next-generation sequencers[J]. Frontiers in Genetics, 2023, 14: 1293974.