真迈生物GenoLab M平台助力绍兴市妇幼保健院中药抗病毒药理机制研究
时间:
2024-02-06
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中药资源是中药产业发展的基础,中药资源研究方法正逐步形成以分子生物学、生物信息学及计算机科学等为主要研究手段的多学科交叉体系。众所周知,中药方剂化学成分复杂,难以找到单一作用靶点,阐明可能的药理,而转录组学可以对药物干预机体的分子变化进行多维度、多靶点的描绘,以弥补单基因研究的不足,全面揭示药理机制,从而为方药有效成分的筛选、新药的发现以及优良种质资源的培育奠定基础,为中西医结合治疗提供数据支撑。


近日,真迈生物的合作单位绍兴市妇幼保健院在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》杂志上发表了题为“Inhibition of Hepatitis B Virus (HBV) replication and antigen expression byBrucea javanica(L.) Merr. oil emulsion”的研究成果。该研究结合分子生物学实验及高通量测序证实:鸦胆子(Brucea javanica(L.) Merr.)油乳剂(BJOE)对人乙型肝炎病毒(HBV)的复制和抗原表达存在明显的抑制作用,且这种作用是通过上调白细胞介素6(IL-6)实现的,揭示了其潜在的抗病毒机理。基于真迈生物GenoLab M高通量基因测序平台对BJOE处理前后的肝癌细胞系HepG2进行转录组测序进一步确定BJOE对肝癌细胞中IL-6基因的影响。本研究为BJOE的HBV临床治疗潜力提供了新的见解,也说明对于真实样本的转录组测序,GenoLab M表现依然优秀,获得学术界的认可。


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*以下为该研究成果解读


背景简介

乙型肝炎病毒(HBV) 感染是目前全球最主要的健康卫生问题之一,慢性HBV感染是导致肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌发生的重要原因。据世卫组织统计:2019年,全球有2.96亿人患有慢性乙肝感染,且每年有150万新发感染者,对公共安全造成很大威胁。HBV是一种DNA病毒,属于嗜肝DNA病毒科,包括三种重要的免疫标记物,也是HBV病毒组装的三个重要组成成分:HBsAg(乙肝表面抗原),HBeAg(乙肝e抗原),HBcAg(乙肝核心抗原)。目前,抗HBV治疗药物主要有两类:α干扰素(IFN-α)和核苷类似物NAs(如lamivudine:中文名拉米夫定,简称LMV)。前者通过直接抗病毒、免疫调节和抗增殖作用发挥抗病毒活性;后者通过模拟生理核苷,靶向HBV逆转录酶,有效抑制病毒DNA复制。但是,由于耐药突变的不断出现、病毒载量的提高及血清中转氨酶的增加,会导致抗HBV药物的疗效显著降低。因此,HBV治疗仍然面临巨大的挑战。


鸦胆子是盛产于我国南方的一种中药材,味苦、性寒、微毒,被报道对多种疾病具有良好的治疗效果,包括癌症、疟疾、痢疾及胃溃疡等。鸦胆子种子提取的重要成分,具有显著的抗植物病毒活性。然而,鸦胆子是否能抗HBV,如能,这种抗性的机制又是怎样的呢?目前尚无报道。本文通过大量的体外实验,研究鸦胆子油乳剂对HBV体外复制、抗原表达及细胞因子分泌的作用,证实其对乙型肝炎的临床治疗潜力,并阐明其可能的抗病毒作用机制。


结果概要


01 研究框架

本研究使用三种肝癌细胞系:Huh7,HepG2以及HepG2.2.15(由HepG2改造而来,可以稳定表达HBV亚复制子和病毒抗原),Huh7和HepG2体外转染HBV-WT(野生型)或HBV-LMV-MT(抗拉米夫定突变型)复制子质粒以实现HBV的稳定复制和抗原表达。使用不同剂量的BJOE处理细胞,通过细胞活性检测、qRT-PCR(实时荧光定量PCR)、CMIA(化学发光微粒子免疫测定)、Western Blot(蛋白免疫印迹)、FCM(流式细胞术)以及RNA-seq(转录组测序)等技术手段,确定BJOE的抗HBV作用机制。


02 BJOE对细胞活力的影响

该研究首先检测在不同的剂量浓度和时间梯度下,BJOE对肝癌细胞活力的影响,以确定合适的BJOE使用浓度,用于后续抗病毒实验,以避免BJOE对细胞产生毒性作用。通过CCK-8实验(细胞增殖和细胞毒性检测)证实(Figure 1E-G):BJOE≤5 mg/ml,作用时间24小时和48小时,均不会造成肝癌细胞活力的明显改变,故后续研究中BJOE使用的最大浓度为5 mg/ml。

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图1 BJOE制备流程图及不同浓度BJOE对细胞活力的影响


03 BJOE抑制HBV复制和抗原表达

随后,研究人员使用BJOE处理HepG2.215,以及转染HBV-WT的HepG2和Huh7细胞。通过qRT-PCR检测发现,与拉米夫定抑制病毒复制的结果类似,BJOE可以有效降低HBV的复制水平,尤其在5 mg/ml使用浓度时,约40%的HBV复制被抑制(Figure 2A-C)。CMIA检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,Western Blot检测HBcAg表达水平,结果表明:三种乙肝病毒抗原在BJOE处理后,都呈现明显的下调,而拉米夫定对HBV抗原表达没有影响(Figure 2D-H)。

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图2 BJOE抑制HBV的复制和抗原表达


04 BJOE调节IL-6的分泌,进而抑制HBV复制

通过FCM检测BJOE处理后肝癌细胞上清中细胞因子的水平,发现BJOE显著增强HepG2和Huh7细胞中IL-6的分泌,但在HepG2.215细胞中,作用并不明显(Figure 3)。为进一步验证BJOE、IL-6和HBV的关系,对转染HBV-WT质粒的HepG2和Huh7细胞分别使用BJOE和DMSO(二甲基亚砜)处理,检测上清中细胞因子的水平,结果表明:DMSO显著下调IL-6的水平,与其促进病毒复制的作用一致;而BJOE显著上调IL-6的水平,结合上述BJOE抑制HBV复制和抗原表达的结果,我们推测BJOE通过上调IL-6从而发挥抗病毒作用(Figure 4A-B)。研究人员为验证上述推测,对HBV-WT转染的HepG2和Huh7细胞,外源加入重组IL-6后,发现两种细胞中HBV的复制及抗原表达均被明显抑制,说明IL-6的上调可以直接抑制HBV的转录和复制,而这种上调是BJOE刺激引起的(Figure 4C-D)。

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图3和4 BJOE通过上调IL-6抑制HBV复制


05 RNA-seq进一步证实BJOE引起IL-6的上调

为进一步探讨BJOE对肝癌细胞中IL-6转录水平的影响,研究人员对BJOE处理的HepG2细胞进行了转录组测序。结果表明:BJOE导致HepG2细胞中IL-6基因上调,且IL-6作为关键基因,在细胞内与多种基因存在相互作用。在GO富集通路中,IL-6广泛参与肝脏相关的生物学过程,包括肝细胞增殖和形态发生,以及肝脏功能实现(Figure 5)。

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图5 转录组测序证实BJOE上调IL-6基因


06 BJOE可有效抑制拉米夫定耐药的HBV复制

HepG2/Huh7细胞转染HBV-WT或HBV-LMV-MT质粒后,使用BJOE或拉米夫定处理细胞,然后通过qRT-PCR及FCM检测HBV的复制及抗原表达。结果表明,5 mg/ml BJOE可以有效抑制WT和LMV-MT的复制,以及HBV抗原的表达;而LMV仅对WT有效,对突变型无效。当两者联合使用时,抗病毒效应被加强(Figure 6)。

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图6 BJOE对WT和LMV-MT HBV都有抗病毒作用


07 鸦胆子碱B诱导IL-6分泌,发挥抗HBV作用

为进一步探讨鸦胆子单一成分的抗HBV作用,研究人员使用鸦胆子苦醇(brusatol)、鸦胆子碱A(bruceine A)、鸦胆子碱B(bruceine B)、鸦胆亭(bruceantin)和鸦胆子苦味素(bruceantinol)分别处理HepG2和Huh7细胞后,检测上清中细胞因子的水平,结果表明:鸦胆子碱B可以上调IL-6的水平(Figure 7A-B),且在HepG2.215中有效抑制HBV复制和抗原表达(Figure 7C)。

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图7 BJOE的关键成分鸦胆子碱B通过上调IL-6抑制HBV复制和抗原表达


结论

基于上述分析,我们得出如下结论:

1、BJOE可以有效抑制HBV复制及病毒抗原表达;

2、BJOE可以调节IL6的分泌,进而发挥抗病毒作用;

3、BJOE不仅对WT病毒发挥有效的抗病毒作用,对LMV-MT病毒同样有效;

4、在BJOE抗HBV作用中,其活性成分--鸦胆子碱B发挥关键作用。

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