在人基因组中，广泛存在着一类非经典DNA（non-B DNA）结构，如G-四链体（G4s）、Z-DNA、发夹结构和H-DNA等，它们区别于经典的B型双螺旋构象，这些结构富集于启动子、增强子、着丝粒和端粒等关键功能区域，在基因调控、染色质组织、DNA复制和基因组进化中发挥关键作用。
然而，由于其易形成复杂二级结构，进而严重阻碍测序酶的延伸，non-B区域长期成为传统测序技术的“盲区”，表现为覆盖度断崖式下降、错误率高等问题。
正因如此，测序技术开发者和科研人员经常要在“覆盖度与数据质量”之间做取舍、找平衡：追求更高覆盖度往往需保留更多低质量数据，导致变异检测假阳性升高；而严格过滤则会造成覆盖缺失，假阴性随之上升。这严重制约了对non-B区域的精准解析及其功能研究。
为突破这一瓶颈，真迈生物研发团队开发了全新的CMS测序技术。为系统评估CMS技术性能，选取标准参考样本（HG001、HG002、HG003）构建PCR-free DNA文库，在SURFSeq 5000（基于CMS技术）、NovaSeq X Plus（NX）和DNBSEQ-T7（T7）三个主流测序平台进行对比测试。其中，CMS平台每个样本设置2次技术重复，共获得6个数据集；NX与T7平台各进行1次测序，分别获得3个数据集。随后，在相同条件下对所有数据集开展生物信息学分析与比较。
基于GRCh37参考基因组GIAB高置信区域开展分析，CMS、NX与T7所有数据集bin的测序覆盖中位深度均处于90.2X至101.9X之间，具备可比性（图1a）。
在整体覆盖均一性方面，CMS的变异系数（CV）最低，表明其全基因组覆盖一致性最优（图1b）。在<0.1x Median depth bin(极端低覆盖区域)的分析中，CMS的低覆盖区域数量平均仅18.5个，较NX（1,623个）减少约90倍，较T7（约2,209个）减少约120倍（图1c）；该优势在<0.3x Median depth分析中依然保持（图1d）。
韦恩图分析进一步揭示（图1e、1f），NX和T7平台各自存在大量特有的低覆盖区域，这反映出方法学差异导致的测序“盲区”差异。而CMS特有的低覆盖区域极少（0.1X阈值下仅5个），其能够高质量的覆盖传统测序平台各自难以测通的区域。
综上所述，CMS在整体覆盖均一性、极端低覆盖区域数量等方面表现优异，为复杂基因组区域（特别是non-B结构）的高质量测序奠定了坚实基础。
图1 低覆盖区间在不同测序平台与样本中的分布
2、CMS技术在non-B DNA区域的覆盖度显著提升
为全面评估CMS技术在不同基因组背景下的覆盖表现，研究分析了全基因组及各类non-B结构区域的归一化深度分布。
结果显示，在全基因组及全类non-B结构区域（图2a、2b），CMS的深度分布曲线集中于归一化深度1.0，形态尖锐对称；而对比平台则呈现明显的“左拖尾”现象，即覆盖度异常低的区间具有较大面积，表明它们在复杂区域存在普遍的深度异常情况。CMS的优势在所有检测的non-B类型中表现出高度普适性（图2c-2i），尤其在G-四链体、正向重复和短串联重复区域最为突出。
上述结果表明，CMS对复杂的non-B二级结构基因区域具有极强的测序能力，从而实现了基因组覆盖完整度的大幅提升。
图2 全基因组及non-B DNA区域的覆盖度分布
通过对全基因组、non-B区域及低覆盖区域（<0.3X、＜0.5X中位深度）的SNV和INDEL变异检出准确性进行系统评估，证实了CMS成功打破了传统测序中覆盖度与准确性之间的“两难抉择”。
在全基因组水平，CMS在SNV检测中实现了最高的灵敏度和精准度。在INDEL检测中，CMS的FN仅约为对比平台的40%，优势明显（图3c-3d）。
在non-B和极端低覆盖区域，CMS的性能优势更为突出，non-B区域中，CMS 的INDEL FN数量较对比平台降低约70%，同时SNV的精准度也显著优于对比平台（图3e-3h）。
综上，CMS技术实现了覆盖度与变异检出保真度的协同提升，为复杂基因组区域的精准变异检测提供了可靠支撑。
图3 不同基因组背景下变异检测准确性的评估
4、CMS技术在T2T基因组和线粒体基因组中的覆盖优势
为克服GIAB高置信度区域对复杂non-B DNA区域的排除所带来的评估局限，研究利用HG002 T2T参考基因组和线粒体基因组做进一步分析。
结果显示，CMS平台在<0.1x和<0.3x中位深度阈值下的低覆盖区间数量分别为3,891和140,559，显著低于NX（25,052和434,387）和T7（49,574和530,037）平台（图4a-4b）。在<0.1x阈值下，CMS低覆盖区间数量较T7和NX分别减少约12倍和6倍。
在线粒体基因组覆盖度分析中，我们还引入了Element AVITI™平台的UltraQ™官方PCR-free WGS数据进行参考分析。CMS的覆盖均一性表现最优，即使在Poly序列、二级结构富集的D-Loop区域也能实现均一、高质量覆盖，而UltraQ™的覆盖波动最为显著，可能与其测序化学有关（图4c）。
综上，CMS在T2T基因组和线粒体基因组中均实现了优异的覆盖完整性与均匀性。
图4 HG002 T2T基因组与线粒体基因组的覆盖深度及均匀性评估
为评估CMS在靶向测序中的性能，本研究对五个GIAB标准样本（HG001–HG005）在CMS和NX平台进行了全外显子组测序（WES）。
结果显示，与NX平台相比，CMS在SNV和INDEL检测中均实现了FP和FN的同步降低（图5a-5d）。利用靶向测序的“浓缩效应”可更灵敏地评估motif驱动的测序偏好，在1.5X深度阈值下，CMS的优势区域是NX平台的17.6倍。在具体示例中，针对基因KMT2D（polyG区域），CMS实现了该区域高质量、高均一性覆盖，而NX平台则表现出Reverse链覆盖度的急剧下降（图5f）。
最后，本研究基于合成生物学技术构建了包含各类测序困难区域的合成Pooling文库。以包含G4基序的文库分子的测序数据为例。NX平台表现了出极端的链偏好性（正反链比约1:166，即正向链无法正常测序）；而CMS的正反链数据则保持了平衡的1:1比率，实现了高质量覆盖（图5g）。
综上，CMS能有效解决复杂二级结构诱导的聚合酶停滞问题，在靶向区域中确保无偏倚的覆盖和准确的变异检测。
图5 CMS在靶向测序中的性能评估
图5f 不同技术平台对KMT2D高GC区域的覆盖表现