近日，广州国家实验室范小英教授团队在Cell Reports(IF 7.5)上发表了题为“Identification of the core regulatory program driving NEUROD1-induced neuronal reprogramming”的研究成果。研究人员建立了大鼠皮层星形胶质细胞体外重编程系统，通过单细胞与多组学测序技术(scRNA-seq、ATAC-seq、Cut&Tag和bulk RNA-seq)系统解析了转录因子NEUROD1(ND1)驱动星形胶质细胞(Ast)向神经元(Neu)转分化的动态轨迹与分子机制。研究发现ND1作为先锋因子通过诱导H3K27ac组蛋白修饰重塑染色质开放性，激活包括Hes6在内的25个关键调控靶点，其重编程过程高度模拟了体内皮层神经发生。这项研究不仅阐明了星形胶质细胞向神经元转分化过程中的独特中间态细胞及核心调控网络，更为神经损伤修复和退行性疾病的治疗提供了革命性策略。本研究采用真迈生物SURFSeq 5000平台完成高质量的转录组测序分析。

成年哺乳动物大脑的神经再生能力极为有限，仅在海马齿状回和侧脑室下区等特定区域维持微弱再生能力，且新生神经元数量极其有限。传统外源细胞移植疗法长期面临细胞存活率低、功能整合差等瓶颈问题。在这一背景下，星形胶质细胞展现出独特的治疗潜力。作为大脑内数量最庞大的胶质细胞群体，它们不仅分布广泛，更在损伤后表现出类似神经干细胞(NSCs)的再生特性。这些特性使其成为内源性神经再生的理想“细胞宝库”。近年研究表明，通过特定干预手段可显著提升胶质细胞的神经转化效率，包括异位表达促神经元转录因子，如NEUROD1(ND1)；microRNA 干扰；PTBP1（一种重要的RNA结合蛋白）基因敲除；小分子化合物处理。作为神经发育过程中的先锋转录因子(TF)，ND1具有快速诱导神经元表型的独特能力，但其动态调控网络仍待阐明。过往研究依赖于bulk RNA-seq，无法解析重编程过程中的细胞异质性和多阶段分子事件。本研究建立无内源性神经元干扰的体外ND1重编程系统，通过单细胞转录组(scRNA-seq)、染色质可及性(ATAC-seq)和组蛋白修饰分析，揭示ND1驱动星形胶质细胞向神经元转化的动态调控网络，为理解神经再生机制提供了新的理论框架。

为探究ND1诱导星形胶质细胞向神经元转分化(AtN)的细胞机制，研究团队建立了体外转分化研究体系。利用新生大鼠大脑皮层分离的原代星形胶质细胞，通过逆转录病毒感染实现ND1的稳定过表达。研究结果显示：在ND1过表达第三天时，经典神经元标志物TUJ1开始表达。随后，通过对0-5天这一关键转换期的scRNA-seq分析揭示了细胞命运决定的动态过程。完成数据过滤后，0天组捕获了13,081个细胞，GFP对照组32,741个细胞，ND1过表达组46,164个细胞。研究者共鉴定出三种主要细胞类型：未成熟星形胶质细胞(ImA)、成熟星形胶质细胞(Astrocyte)和神经元细胞(Neuron)。其中ImA可进一步分为三个亚群：增殖态ImA_div、静息态ImA以及高表达ND1的ImA_ND1_hi，这些亚群均高表达Gfap与Tnc。Astrocyte也包含三个亚群：高表达Gfap/Tnc/Col11a1的Ast_1，以及高表达Atp1a2/Aqp4的Ast_2与Ast_3。神经元分为4个亚群(Neu_1至Neu_4)，均高表达神经元标志基因，且功能富集于轴突发生，树突发育，神经元迁移，以及细胞突起调控等神经相关通路。随着时间推移，细胞类型发生明显变化：0天时，80%细胞为ImA，GFP对照组主要为ImA和Astrocyte，而ND1过表达组大部分细胞(52.5%)转分化为神经元。第14天时，80%的GFP⁺星形胶质细胞转为TUJ1⁺神经元，且超过90%为VGLUT1⁺兴奋性神经元，其中TBR1⁺与CTIP2⁺细胞占比较高。30天时，转分化的神经元已具备类似胚胎16.5天大鼠皮层神经元的电生理特性，主要形成功能性兴奋性神经环路，其放电频率与振幅与原代神经元相当。这些结果证实了ND1能在大鼠星形胶质细胞中实现快速高效的体外神经元重编程，首次揭示了通过ImA_ND1_hi过渡态的转分化轨迹，明确了神经元转分化过程中的连续细胞状态。

图1 ND1诱导AtN过程中的细胞类型多样性

通过整合多种ND1驱动的神经元分化系统，研究者对ND1的ChIP-seq数据集进行了重新分析，并与本研究的AtN体系Cut&Tag数据进行了系统比较。研究团队共鉴定出40个跨系统保守的ND1直接靶基因(包括已知的Hes6, Mfap4, Smad3等)，这些基因显著富集于神经系统发育相关通路。基于scRNA-seq数据构建的基因调控网络，进一步将靶基因范围缩小至25个与ND1表达密切相关的关键调控因子，其中20个基因显著上调，证实ND1在AtN过程中主要发挥转录激活作用；同时发现5个下调的星形胶质细胞相关基因，提示ND1还具有直接抑制胶质细胞特性的功能。转录因子活性分析显示，Hes6和Smad3在AtN过程中活性发生显著改变，本研究新发现的靶点Meis2在转化细胞中表现出显著的TF活性增强。为验证这些核心调控因子的功能，研究者通过shRNA对Hes6和Meis2进行了敲低，并结合真迈生物SURFSeq 5000平台的bulk RNA-seq分析转录组水平的变化。Hes6敲低导致晚期神经发生基因(如Tubb3、Slc1a、Slc17a7)显著上调，同时伴随TUJ1⁺/GFAP⁺双阳性细胞比例增加，提示Hes6通过防止神经元基因过早激活来确保转分化的时序性。Meis2敲低显著降低内源ND1表达及其调控的神经元发生基因，降低转分化效率，表明Meis2通过维持ND1的表达从而驱动完整的神经元重编程。这些发现不仅揭示了ND1通过共同的核心靶基因网络调控神经元分化的分子基础，还阐明了Hes6和Meis2在AtN中的作用机制。

图2 参与神经元重编程的关键ND1靶点