基于GenoCare单分子测序平台的微量细胞测序
时间:
2020-02-14
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2020年1月,由中信湘雅生殖与遗传专科医院(以下简称“中信湘雅”)林戈课题组和深圳市真迈生物科技有限公司(以下简称“真迈生物”)联合组成的研究团队在预印本服务网站BioRxiv在线发表了题为Accurate CNV identification from only a few cells with low GC bias in a single-molecule sequencing platform的学术论文。


论文结果展示,团队合作研发的基于GenoCare单分子测序仪的微量细胞检测方案在检测灵敏度和时间上优于传统NGS(Next generation sequencing)检测方法,这是我国自主开发的单分子测序平台首次应用于单细胞及微量细胞研究领域的案例,研究成果将进一步推动国产基因测序平台在未来临床研究和应用中的广泛普及。


中信湘雅联合真迈生物首次发表基于GENOCARE单分子测序平台的微量细胞研究成果


在基于微量细胞进行拷贝数异常(CNV,Copy number variation)分析的科研及临床诊断的多种应用中,NGS(Next generation sequencing)相比于传统的FISH(Fluorescence in situ hybridization)、aCGH(Array comparative genomic hybridization)芯片检测等技术具有更高的检测分辨率和更大的发展潜力。尽管已有的NGS技术在这一领域的应用已较为成熟,但仍有改进和提升的空间。


首先,由于获取的样本细胞数极少,受限于二代测序平台对建库起始量的要求,必须在建库前对样本进行全基因组扩增(Whole Genome Amplification, WGA)。尽管WGA技术在不断发展,其扩增过程中引入的偏差仍会或多或少地影响检测结果的可靠性和灵敏度;其次,现有检测方法建库流程较为复杂,导致整体检测周期较长,一般来说从样本制备到获得最终的检测结果至少需要2天的时间。现有技术的普及还受到成本较高的限制。


基于这些亟待解决的问题,中信湘雅联合真迈生物共同研发出了一套基于单分子测序技术的微量细胞CNV检测体系,在保持检测结果准确度的同时提升染色体异常检测的灵敏度,大大降低检测过程的复杂度以及检测成本。该研究团队开发了一种基于细胞直接裂解结合Tn5转座酶系统的建库方法,可以跳过传统意义上的WGA步骤直接进行建库,采用该方法可对低至5个细胞进行直接裂解建库,并成功在单分子基因测序仪GenoCare 1600上完成了测序和数据分析。研究结果表明,相比于基于WGA的建库方法,该建库方法具有明显更低的GC偏好(图1)。


中信湘雅联合真迈生物首次发表基于GENOCARE单分子测序平台的微量细胞研究成果


图1 基于不同建库方法的GC 偏好对比


为了验证该体系的染色体异常检测能力,该研究对6种带有不同染色体微小结构变异的细胞系进行了检测(其中最小的染色体结构异常为1.29M的一段染色体缺失),并将单分子测序系统的分析结果与二代测序平台Illumina HiSeq X Ten的结果进行了一致性分析。研究结果表明,该检测体系的分析结果与基于二代测序平台的分析结果完全一致,对低至1.29M的染色体结构异常可准确检出(图2)。


中信湘雅联合真迈生物首次发表基于GENOCARE单分子测序平台的微量细胞研究成果


图2  基于GenoCare 1600与HiSeq X Ten的CNV测序结果对比(染色体异常:46, XX, del(1p36.33-1p36.32) 1.29M)


在基于微量细胞为研究样品的不同应用场景中,嵌合一直是困扰科研人员的一个重要因素。如在植入前胚胎中,染色体非整倍体嵌合情况较为常见。而不同类型和比例的嵌合对临床结局有一定影响。因此,对于少量细胞的染色体非整倍体嵌合状况进行准确检测显得尤为重要。根据国际植入前遗传学诊断学会PGDIS(Preimplantation Genetic Diagnosis International Society)的建议,高于80%的异常嵌合建议按非整倍体处理,低于20%的异常嵌合建议按整倍体处理,介于20~80%之间的异常嵌合可作为临床医生的参考,根据具体情况来选择处理方案。该研究团队同时对该检测体系的嵌合异常胚胎的检出效力进行了评估,将正常细胞系gDNA与染色体异常细胞系gDNA按0%~100%的不同比例进行混合模拟不同的嵌合比率进行建库测序检测分析。结果表明,该检测体系可对低至20%的异常嵌合成功检出(图3)。


中信湘雅联合真迈生物首次发表基于GENOCARE单分子测序平台的微量细胞研究成果


图3 基于GenoCare 1600的微量细胞系CNVs检测结果


(染色体异常:46, XY, dup(2p25.3-2p16.2) 53.26M,20%嵌合)


 论文第一作者、中信湘雅胡亮博士表示,中信湘雅一直致力于与国内同道共同推进植入前遗传领域新技术的研发、应用和推广。与现有检测方法比较,本次基于Tn5转座酶系统建库并利用GenoCare单分子测序平台进行CNV检测,在保持高准确度的同时,尽量减少了WGA引起的GC偏好性。另外,该策略的检测流程也比较简单。


论文共同通讯作者、真迈生物医学研发总监张萌表示,作为一种新的平台方案,基于单分子测序的微量细胞检测在灵敏度、时间和成本上都具有明显的优势。期待这种新的方法能为科研工作者的研究提供一种新的思路,我们也会通过不断的测试和完善去推动它早日作为一种筛查诊断方案应用至临床,造福更多的普通人。


据悉,中信湘雅与真迈生物将进一步完善实验设计,适时开展相关基础及临床研究,以充分验证和推动单分子基因测序技术的广泛应用。


关于中信湘雅


中信湘雅生殖与遗传专科医院(原中南大学湘雅医学院不孕与遗传专科医院)是现代化大型生殖与遗传专科医院,前身是中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室门诊部。


自1980年在我国医学遗传学奠基人卢惠霖教授的指导下,卢光琇教授在国内开展人类辅助生殖技术研究和临床工作以来,先后于1988年被卫生部批准为国家精子库技术指导中心,2007年成为卫生部公布的人类辅助生殖技术和人类精子库技术培训基地,2017年成为国家基因检测技术应用示范中心(湖南孕前诊断分中心)。


医院历经30余年的探索和实践,现已经发展成为经卫生部审查批准,拥有湖南地区合格人类冷冻精子库的三级生殖与遗传专科医院。2017年获全国卫生计生系统先进集体荣誉称号,同年获湖南省创新奖。


关于真迈 


真迈生物(GeneMind Biosciences)创立于2012年,总部现设于深圳罗湖,拥有办公、研发和生产场地共8000余平米。真迈生物专注于基因测序产业上游设备和试剂的研发制造,以自主开发的第三代单分子基因测序仪为核心,具备从原料、试剂到设备、软件的全流程解决方案,是国际上屈指可数的拥有自主基因测序仪品牌的硬科技企业。


真迈全职团队共100余人,其中经政府认定的“高层次人才”占25%以上,海内外研究生学历50%以上。公司拥有180余项国内外专利授权和申请(包括中国、美国、欧洲等地区),17项计算机软件著作权,覆盖基因测序平台的“仪器-试剂-芯片-算法-应用”全流程模块。


真迈生物拥有自主开发的国产单分子基因测序仪GenoCare及配套试剂盒,可无需扩增直接检测DNA信息。目前,GenoCare已通过医疗器械注册检验,单分子测序通用试剂盒已获得第一类医疗器械备案资质。同时,GenoCare单分子基因测序仪等5项产品已获得欧盟CE标志,是首个获得欧盟CE标志的国产第三代基因测序仪产品。

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